È uno dei musei più famosi del mondo per le sue straordinarie collezioni di dipinti e di statue antiche. Le sue raccolte di dipinti del Trecento e del Rinascimento contengono alcuni capolavori assoluti dell'arte di tutti i tempi. Basta ricordare i nomi di Giotto, Simone Martini, Piero della Francesca, Beato Angelico, Filippo Lippi, Botticelli, Mantegna, Correggio, Leonardo, Raffaello, Michelangelo, Caravaggio.
Importanti sono anche le raccolte di pittori tedeschi, olandesi e fiamminghi. Tra questi: Dürer, Rembrandt, Rubens.

La Galleria è situata all'ultimo piano del grande edificio costruito tra il 1560 e il 1580 su progetto di Giorgio Vasari come sede dei principali uffici amministrativi dello stato toscano. Fu realizzata per volontà del granduca Francesco I e arricchita grazie al contributo di numerosi componenti della famiglia Medici, appassionati collezionisti di dipinti, sculture e oggetti d'arte. Fu riordinata e ampliata sotto la dinastia dei Lorena, succeduti ai Medici, e in seguito dallo Stato italiano.

Nel complesso vasariano sono ospitate altre importanti raccolte: la Collezione Contini Bonacossi e il Gabinetto Disegni e Stampe degli Uffizi. Corridoio Vasariano: un corridoio sospeso realizzato dal Vasari nel 1565, collega l'edificio degli Uffizi con Palazzo Vecchio e con Palazzo Pitti. Vi sono esposte importanti raccolte di dipinti del Seicento e la collezione degli Autoritratti.